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无菌工艺模拟试验指南（无菌原料药）
1.目的
为指导和规范无菌原料药生产企业开展无菌工艺模拟验证，充分评价无菌原料药生产过程的无菌保障水平，确保所生产无菌原料药的安全性，依据《药品生产质量管理规范》（2010版）及附录，制定本指南。
2.定义
本指南所述的无菌工艺模拟试验，是指采用适当的培养基或介质，模拟原料药生产中无菌操作的全过程，以评价该无菌工艺无菌保障水平的一系列活动。
3.范围
3.1.本指南涵盖了无菌原料药无菌工艺模拟试验的基本要求、不同工艺模式的特殊要求、试验的基本流程等内容，适用于无菌原料药的无菌工艺验证。
3.2.本指南所述条款是在现有无菌工艺技术基础上提出的相关要求，旨在规范企业开展无菌工艺模拟试验活动。在科学的基础上，鼓励新技术、新设备的引入，以提高无菌原料药无菌保障水平。
4.原则
在对无菌生产工艺充分认知和生产经验累积的基础上，应结合工艺、设备、人员和环境等要素定期开展无菌工艺模拟试验，以确认无菌生产过程的可靠性，同时也为企业及时识别风险进而改进无菌控制措施提供数据支持。开展无菌工艺模拟试验应遵循以下原则：
4.1.以现行药品GMP法规要求为准则，评价无菌生产过程的法规符合性，不符合规范要求的无菌工艺过程，不能通过模拟试验来证实其无菌保证措施的合理性。
4.2.基于无菌工艺设计，对无菌生产过程实施风险评估，识别生产过程风险点以便评估现有控制措施的有效性，评估结果应在试验方案设计时给予考虑。
4.3.基于无菌风险，应充分考虑硬件装备水平与无菌风险的关联性，结合无菌生产过程所涉及到的工艺、设备、人员以及操作时限等因素针对性开展模拟试验，尽可能模拟实际无菌生产全过程，应特别关注“开放”操作、人工干预等高风险过程。
4.4.如生产线有多种无菌生产工艺，应评价模拟试验方案对各无菌工艺过程的适用性。应对有显著差异的无菌工艺过程开展模拟试验，或在综合评价不同无菌生产工艺的基础上，设计模拟验证，以评价每种无菌工艺过程的可靠性。
5.无菌原料药生产工艺及模拟范围
无菌原料药的无菌生产工艺通常为：原料药进一步精制和无菌操作的结合，作为无菌原料药生产工艺的开始，多采用除菌过滤或其他除菌技术将物料中的微生物去除，之后采取无菌操作技术的工艺单元，最终获得免受微生物污染的原料药。无菌工艺模拟试验应从第一步无菌操作开始，即经除菌过滤或其他方法获取无菌药液，直至无菌产品完全密封结束。
与无菌制剂工艺相比，无菌原料药的生产工艺一般更复杂，工艺设备选型呈现出非标化和功能设计差异化等特点。即使是同一无菌工艺过程，因设备选型和系统密闭程度的不同，无菌风险也存在着显著差异。
目前，无菌原料药常用无菌工艺包括：结晶工艺、冷冻工艺和喷雾干燥工艺。
5.1.无菌结晶工艺
典型的结晶工艺流程是从非无菌物料开始，经除菌过滤进入无菌结晶罐内，通过调整物料温度或加入其他溶剂使物料中有效活性成分结晶或沉淀析出，该过程会因控制晶体生长的需要而引入晶种。养晶结束后进入固液分离设备，去除母液获得湿品，必要时对湿品进行洗涤，湿品在固液分离设备内进行干燥或通过辅助密闭系统转移至其他干燥设备内进行干燥，之后根据产品特性和最终质量要求进行必要的整粒（或微粉化），以控制产品粒度大小和分布，混粉也是常用的工艺单元，主要解决产品均一性的问题。最后产品经分装、密封，将产品严封于容器内。
5.2.无菌冻干工艺
常见的无菌冻干工艺流程包括：液体物料经除菌过滤得到无菌料液，在无菌防护下使用加料枪将无菌料液注入冻干机托盘内，按照规定程序进行冷冻真空干燥，干燥结束后经除菌级呼吸器释放冻干机内的真空。在无菌防护下打开冻干机门，将干品由托盘转移至无菌料仓内，或在无菌防护下通过真空密闭吸料系统将干品转移至下一工序，干品通常需要整粒和混粉工艺，以得到质量均一的干品，最后经分装、密封，将产品严封于容器内。
5.3.无菌喷雾干燥工艺
无菌喷干工艺适用于耐热性好的无菌原料药，工艺流程通常包括：液体物料经除菌过滤后持续稳定地注入干燥塔内，在无菌高压空气的作用下瞬间雾化成液滴，并与流动的无菌热空气发生传质传热，液滴因水分迅速蒸发而变为粉末状干品，获得的干品经气固分离器收集至无菌料仓内，或直接分装至最终市售包装内。产品在料仓内可实现进一步混粉操作，随后经分装机完成干品的分装、密封等过程，将产品严封于容器内。
5.4.密闭与开放系统
通常无菌工艺由一系列的无菌单元操作组成，单元操作分为“密闭”或“开放”系统，采用“密闭”系统可更好的保障无菌水平。关键的无菌操作如采用了“开放”系统，宜使用隔离操作技术进行无菌防护。模拟试验应包括无菌工艺的各单元操作系统以及各单元间的转运系统。
5.4.1.“密闭”系统
“密闭”系统是通过物理隔离的方式，阻止环境中微生物进入系统内部，保护药品免受外界的污染。因“密闭”系统设计上的优越性，在无菌操作过程提供了可靠的无菌保护措施。企业进行无菌原料药工艺设计时，应尽量考虑采用“密闭”系统的可行性。“密闭”系统至少具备以下特征：
能够实现在线灭菌（SIP）或系统在使用前进行密闭和灭菌。
基于结构的优化设计，能够在一个生产周期内保持系统的完整性。
且在与其他密闭系统连接时，能够保持系统完整性不受破坏。
在实施预防性维护过程中，有相应措施保护系统的完整性。
5.4.2.“开放”系统
“开放”系统是不符合“密闭”系统规定的一项或多项特征的系统，开发系统条件下进行的操作是影响最终药品无菌特性的重要环节，如设备（或管道）的无菌连接、分装过程容器的更换等，是引入微生物污染的高风险过程。模拟试验方案设计时应重点考察以上过程中无菌保障措施的有效性。
6.模拟试验方案的设计及实施过程要求
模拟试验是一个系统性工程，通过模拟无菌生产工艺全过程，证实生产过程中无菌保障措施的有效性。因此，模拟试验实施过程应关注以下几方面：
6.1.开展模拟试验的前提条件
在无菌工艺模拟试验之前应确认与无菌工艺相关的支持性系统和灭菌系统的验证已完成，并达到了可接受的标准。
6.1.1.工艺设备、公用系统和辅助设施按照预期要求完成了设计、安装及与无菌生产有关的性能确认。
6.1.2.工艺设备、公用系统、辅助设施灭菌方法完成了相应的验证，物品及厂房、设施所使用消毒剂及消毒方式完成了相关的验证。
6.1.3.药液及与产品接触的气体、设备组件、容器、器具灭菌工艺完成了相应的验证。
6.1.4.无菌生产区域的气流及环境达到了设计要求，并能稳定运行。
6.1.5.根据无菌生产工艺要求建立了相关受控操作文件。
6.1.6.参与模拟灌装试验的人员接受了药品GMP、无菌操作、微生物知识以及实施模拟试验的培训。
6.1.7.进入无菌洁净区的全部人员通过了更衣程序的确认，确认了每位参与者可进入的区域和其所允许的无菌操作项目，并采用文件形式或其他限制措施。
6.2.基于无菌风险的模拟试验方案的设计
模拟试验方案设计应结合无菌生产工艺，尽量与实际无菌操作过程保持一致，以求试验结果真实反映生产过程的无菌保障水平。
6.2.1.无菌生产工艺的风险评估
无菌生产工艺的设计基于对产品特性、工艺技术和无菌保证措施的认知和经验的累积，设计模拟试验方案前应对无菌生产过程开展系统性风险评估，以充分识别无菌生产过程中潜在风险点。
6.2.2.模拟试验方案设计时，应重点考察和评估高风险无菌操作过程，如溶媒结晶工艺中引入晶种的过程。无菌生产工艺的暴露操作是影响最终原料药无菌特性的重要环节，如设备（或管道）的无菌连接、无菌容器的转运和更换、灌装等关键操作，模拟试验方案设计应考察以上过程无菌保证措施的有效性。
6.2.3.证实无菌操作人员满足无菌生产要求，是实施模拟试验的目的之一，有人员参与的无菌操作，应考察评估来源于人员的污染途径。进行模拟试验方案设计时，应结合工艺过程中的“开放”环节，重点考察有人员参与的关键操作，评价人员素质和防护措施的可靠性。
6.2.4模拟介质的选择与评价
6.2.4.1模拟介质的选择
应考虑模拟介质与无菌工艺的适宜性，结合被模拟产品的特点以及模拟介质的可过滤性、澄清度、灭菌方式等方面选择模拟介质，以尽可能模拟无菌生产工艺。不应选择具有抑菌性的模拟介质，以确保模拟试验结果的可信度。通常可采用的模拟介质包括：促进微生物生长的培养基、安慰剂物料等，一般情况下推荐使用培养基（如TSB）。
6.2.4.2培养基的选择
胰酪大豆胨液体培养基（TSB）是一种广谱性培养基，特别对无菌工艺环境中源自人体的细菌、芽孢和真菌有良好的促生长效果，是无菌工艺模拟试验常用的培养基。
如果产品需充入惰性气体、储存在无氧条件，无菌操作在严格的厌氧环境中进行时（即氧气浓度低于0.1%），应考虑采用厌氧培养基如硫乙醇酸盐液体培养基（FTM）。在厌氧的无菌工艺环境监控中反复发现厌氧微生物或在产品无菌检查中发现厌氧微生物时，需评估增加厌氧培养基。
用于模拟抑菌性产品的培养基，如有必要需评估抑菌性产品残存对其促生长能力及模拟试验结果的影响。
包含动物来源成分的培养基，应考虑培养基引入外源污染的风险。如针对BSE（可传染性海绵脑病）/TSE（疯牛病）可提供无BSE（可传染性海绵脑病）/TSE（疯牛病）证明，亦可选用植物来源的培养基。
6.2.5.培养基的配制
6.2.5.1.模拟试验的培养基应在控制区域进行准备，需注意培养基粉尘在环境中的扩散、残留及去除，防止其残存于环境及设备表面而造成微生物滋生。通常按照最终培养浓度3%的要求配制培养基。配制后的培养基应尽快灭菌或除菌过滤，宜进入无菌储罐或容器储存备用。
6.2.5.2.培养基在模拟试验前应恢复至室温，即用型无菌液体培养基储存条件和使用条件应遵循生产商要求。
6.2.6.培养基的除菌与灭菌
6.2.6.1.除菌过滤
采用除菌过滤的方式便于同生产工艺衔接，但在培养基选择阶段应考虑其过滤性。由于培养基的特性与药液有差异，培养基除菌过滤的滤器型号可与产品使用的过滤器不同，培养基颗粒或生物负载较大等原因引起除菌过滤器的堵塞时，可增加预过滤。亦需考虑降低非无菌培养基中细菌和霉菌生长的风险，以避免微生物生长导致培养基过滤性能降低。针对以上情况应进行风险评估并采取合理应对措施。
6.2.6.2.湿热灭菌
如用于模拟试验的大体积培养基采用在线灭菌或灭菌釜湿热灭菌，会产生受热不均匀或灭菌不充分现象。应对该灭菌方式进行风险评估和验证。
灭菌过程应遵循生产商推荐的灭菌时间和温度的建议，并对灭菌过程予以确认，以确保灭菌后培养基的促生长能力，避免过度灭菌使培养基碳化造成降低其促生长性能。
为避免过度加热可采用湿热灭菌与除菌过滤联合使用的方式，但均应进行促生长能力试验。
6.2.6.3.辐照灭菌
使用辐照灭菌的培养基粉末，应在无菌环境下进行无菌配置等操作。辐照灭菌过程应经验证，验证中应使用耐辐射的菌种，并在产品质量报告体现菌种、剂量信息等重要验证信息。
6.2.7.培养基促生长能力试验
6.2.7.1.应在无菌工艺模拟试验前或同时，及14天培养后按照现行中国药典方法对培养基进行促生长能力试验，并且用于促生长能力试验的培养基应与用于模拟工艺试验培养基经过相同工艺（如除热源、灭菌、充氮、灌装、冻干等），以证明本次验证所用培养基的性能。
6.2.7.2.培养基促生长能力试验使用的菌种，如：白色念珠菌（CMCC98001）、黑曲霉（CMCC98003）、枯草芽孢杆菌（CMCC63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、铜绿假单胞菌（CMCC10104）、生孢梭菌（CMCC64941），在试验中除标准菌株之外应考虑加入环境和无菌检查中发现的典型微生物。促生长试验接种量应不大于100CFU。
6.2.8.其它模拟介质的选择及评价
6.2.8.1.其它模拟介质的选择
对于无菌粉末产品及特殊剂型产品，如悬浊液、软膏/乳膏/乳液/凝胶等，在无菌工艺模拟试验中会使用其它模拟介质，如安慰剂、赋形剂等，根据剂型特点、生产工艺及设备、模拟介质特点选择适当的模拟介质。模拟介质的流动性应尽可能类似于被模拟产品，并应易于进行分装等工艺操作。模拟介质还应易于灭菌，无抑菌性，易溶解或易分散至培养基中。常用模拟介质有聚乙二醇、乳糖、甘露醇、氯化钠、凡士林等。模拟介质的灭菌过程应经验证并提供相关报告，其内容包括灭菌方式对模拟介质特性有无不良影响，灭菌后的无菌性，如采用辐照灭菌包装形式应与在模拟试验时使用的一致等重要信息等。模拟试验使用的模拟介质包装形式应与被模拟的无菌粉末保证形式一致。
6.2.8.2.其它模拟介质的评价
在使用模拟介质前应对其适用性进行确认，包括无菌试验、抑菌试验、溶解度试验以及溶解时间实验等。抑菌试验通常使用枯草芽孢杆菌（CMCC63501）和白色念珠菌（CMCC98001），应考虑加入环境和无菌检查中发现的典型微生物。无菌模拟介质由无菌WFI溶解后，加入到无菌培养基中，达到模拟工艺选用的浓度范围，通常是1%-5%，每个浓度接种10-100CFU，阳性对照接种到不含无菌模拟介质的试管中，在20-25℃培养7天所有试管应明显浑浊。
6.3.模拟灌装数量和持续时间
6.3.1.无菌工艺模拟灌装数量应足以保证评价的有效性及完成模拟方案中设计的各种干预活动，应不低于正常生产批量。应通过风险评估对所设计的灌装数量、持续时间、模拟方式、预期收率作出合理说明。
6.3.2.模拟试验所用模拟介质的数量，应能够覆盖无菌工艺设备的全部内表面，特别是混粉过程，应确保模拟介质覆盖混粉器内壁全部表面。
6.3.3.考虑到模拟最差条件的需要，模拟试验维持时间不应低于实际生产用时。
6.4.容器装量
容器中培养基灌装量应考虑适宜微生物生长的需要和容器内表面覆盖的要求，灌装量不必与产品相同，通常应能达到容器体积的1/3～1/2，即可保证产品通过倒置和旋转接触到所有内表面并有足够的氧气支持微生物的生长，以利于对培养基的观察。
6.5.模拟试验方法的选择
通常无菌原料药生产工艺由多个工艺单元构成。模拟试验方案的设计应考虑试验过程可连续性问题，以确定采用连续工艺模拟还是分段模拟。
6.5.1.连续工艺模拟方式
6.5.1.1.这种模拟方式是将整个无菌过程视为一个整体，模拟介质不间断地完成各个单元操作，并在最终分装容器内进行无菌培养和判定，以评价生产过程的无菌保障水平。
6.5.1.2.连续工艺模拟方式的选择，取决于模拟介质在模拟过程中的适用性，如喷雾干燥工艺可采用液体模拟介质，通过模拟喷雾干燥过程，可将液体模拟介质转化为固体模拟介质，进而实现分装、密封等过程。
6.5.1.3.连续工艺模拟可以真实反映整体无菌保障水平。但也有其不足之处，如发现污染，调查污染源的难度较大。
6.5.2.分段模拟方式
6.5.2.1.分段模拟方式是将无菌生产过程按照工艺单元分割成若干段，逐段进行模拟试验，分段数量取决于工艺过程和模拟介质。模拟试验最终的结果是各段独立模拟试验结果的累积，对一些无菌工艺而言，该方式可根据需要变换采用固体或液体模拟介质，保证与实际工艺过程的一致。
6.5.2.2.分段工艺模拟的优点是可以特定评价某一单元操作的无菌风险，如发现微生物污染，相对于连续工艺模拟更易于发现污染源，进而采取针对性纠正措施。
6.5.2.3.分段模拟方式也有不足之处，如：需要更多种类或数量的模拟介质；模拟介质需要多次无菌化处理，增加潜在污染风险；需要采集更多的物料、环境和人员监测样本进行评价。
6.6.最差条件的选择
最差条件并不是指人为创造的超出允许范围的生产状况和环境。为了确认无菌工艺风险控制的有效性，应通过风险评估并结合无菌生产工艺、设备装备水平、人员数量和干预等因素来设计模拟试验最差条件。包括但不限于以下方面：
6.6.1.人员
应充分考虑人员及其活动对无菌生产工艺带来的风险，如模拟生产过程的最多人数，当操作人员数量减少可能导致其它方面污染风险增加时，则此类条件也视为最差条件之一。参与人员应包括日常参与到无菌生产的全部人员，如生产操作、取样、环境监测和设备设施维护人员，同时应考虑以上人员交叉作业、班次轮换、更衣、夜班疲劳状态等因素。
6.6.2.工艺时间
应考虑模拟实际生产操作过程中设备设施、分装器具、最终容器消毒或灭菌后放置的最长时间及最长的工艺保留时限等，如：混粉或分装前的等待时限。
